ELISA方法测定单克隆抗体实验原理及操作步骤

ELISA方法测定单克隆抗体实验原理及操作步骤
一、实验目的
1. 深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。
2. 掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。
二、实验原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的gao效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子
上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA 法是免疫酶技术的一
种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既包证了反应的定量关系，也
避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA法中。 酶促反应只进行一次， 而抗原/抗体的免疫反应可进行一次或数次， 即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。
目常用的几种ELISA方法有:测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。其主要过程为:先将已知定量抗
原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目

测或光电比色测定抗体含量。

三、仪器、原料和试剂
1.仪器
（1.1）聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。
2.原料
（2.1）单克隆抗体
3.试剂
（3.1）抗原及酶标记抗体
（3.2）抗原:兔抗人lgG(Rabbit Aanti-human lgG， Code No. A0423);
（3.3）酶标抗抗体:兔抗鼠lgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP， Code No. P0260);使用时按照说明书要求稀释。
4.洗涤液(含0.05% Tween 20的PBS): 1LPBS 中加入Tween-20 500μ L.
5.封闭液(含1%牛血清白蛋白，0.1% Tween 20的PBS): 10mLPBS 中加入100mgBSA, 10 μ LTween-20.
6.底物溶液
（6.1）磷酸钠盐缓冲液(0.1mol/LpH6.0):称Na2HPO4 .12H2O2.2g，NaH2PO4 . 2H2O 6.84g，用蒸馏水溶解，定容至500mL.
  (6.2) TMB贮液:称60mgTMB 溶于10mL二甲基亚砜中，4℃避光保存。
（6.3）底物应用液:现用现配，磷酸钠缓冲液10ml, TNB 贮液10μ L.30% H2O2 15μL,混匀。
7.终止液: 2mol/LH2S04
四、操作步骤
1、抗原包被:兔抗人lgG作为抗原，用包被液1: 8000稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜。
2、洗涤:次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。
3、封闭:加100μ L/孔封闭液，室温放置0.5h.
4、洗涤:用洗涤液洗3次。
5、加待测样品(一抗): 将含单克降抗体的细胞培养上清在另块板上用PBS连续稀释(按照1: 2或1: 10)， 100μ L /孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，PBS 或空白培养
基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。加盖37℃恒温箱温育1~2h.
6、洗涤:用洗涤液洗3次。
7、加酶标抗抗体:兔抗鼠IgG-HRP， 用封闭液1: 8000稀释，100μL/孔， 加盖37℃恒温箱温育1h.
8、洗涤:用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。
9、显色:加新鲜配制的底物溶液100μL孔，室温暗处放置5~30min，显示蓝色。
10、终止反应、比色。加50μL/孔终止液。颜色变黄:用酶标仪测定450nm
处各孔的吸光值， 阳性反应的蕞大稀释度为待测样品的效价。